ATTO PRIMO
Nello studio legale di Kolenatý, che provvede a un’esposizione dettagliata del caso; Emilia sopraggiunge fornendo le sue preziose notizie. Mentre Kolenatý si reca a prelevare il testamento a casa di Prus, il fascino di Emilia ha occasione di esercitarsi anche su Gregor. Questi se ne innamora perdutamente, ma viene respinto con glaciale e annoiata indifferenza. Avendo Gregor ai suoi piedi, Emilia ne approfitta per domandargli del documento che reca la formula della pozione, ma apprende da Kolenatý, di ritorno da casa Prus, che questo è rimasto in possesso del barone.
ATTO SECONDO
Dietro le quinte dell’Opera, la mattina successiva a una rappresentazione che l’ha avuta per protagonista, Emilia continua a trattare con crudele durezza pretendenti e ammiratori. A Gregor, a Krista e Vítek si aggiungono Janek, il figlio di Jaroslav Prus, e il vecchio e ormai demente conte Hauk-Sendorf. In Emilia egli ha riconosciuto Eugenia Montez, la gitana di cui si era invaghito cinquant’anni prima in Andalusia. A Emilia si presenta quindi Jaroslav Prus; insospettito dalle inesplicabili conoscenze di Emilia sulla sua famiglia e dal suo immotivato interesse alla causa di Gregor, mette la cantante alle strette. Emilia induce il giovane Janek a tentare di sottrarre il documento per lei. Al tempo stesso tenta di comperare il documento da Prus, che acconsente a cederglielo in cambio di una notte d’amore.
ATTO TERZO
Nella stanza d’albergo ove Emilia e Prus hanno trascorso insieme la notte. Arriva la tragica notizia del suicidio d’amore di Janek. Di fronte al dolore di Prus, Emilia reagisce con assoluta indifferenza, restandosene seduta a pettinarsi i capelli. Prus fa appena in tempo a manifestarle il suo incredulo sdegno allorché sopraggiungono Gregor, Kolenatý e il conte Hauk. Kolenatý e il suo assistito sono decisi a denunciare Emilia per frode, a causa delle sospette e inesplicabili contraddizioni del suo racconto, in cui risultano confuse e sovrapposte le figure di Elian McGregor e di Elina Makropulos. Emilia si decide infine a raccontare l’autentica versione della sua inverosimile storia: ella è stata Elian, Elina e molte altre ancora. Ma viene creduta solo quando i primi segni di morte appaiono sul suo volto, ora che la pozione sta esaurendo i suoi effetti. Emilia rinuncia a servirsi della pozione e decide di lasciarsi morire, comprendendo che la sua perpetua giovinezza non dà altro che dolore e apatia. Solo chi vive nell’imminenza inesorabile della morte, rivela Emilia in un appassionato addio ai presenti, può provare qualcosa come la felicità: «Oh! la vita non dovrebbe durare così a lungo! Se solo vi accorgeste come è facile per voi la vita! Voi siete così vicini a ogni cosa! (...) Per la banale, fortuita ragione che morirete in così breve tempo». Emilia muore mentre il documento che cela il ‘segreto Makropulos’, da lei donato con le sue ultime parole alla giovane ammiratrice Krista per farne un’altra prodigiosa cantante, viene dato alle fiamme.