ERSTER AKT
Zimmer im Hause Eisensteins. Vom Garten her hört man ein Liebeslied klingen. Rosalinde erkennt den verführerischen Tenor ihres einstigen Gesangslehrers und Verehrers Alfred. Ihr Zofe Adele bittet um Ausgang, um eine kranke Tante besuchen zu können - in Wirklichkeit will sie an einem Fest des Prinzen Orlowsky teilnehmen, zu dem sie von ihrer Schwester Ida brieflich eingeladen wurde. Rosalinde schlägt ihr aber die Bitte ab, denn sie will nicht allein bleiben; muss doch ihr Gatte heute eine Arreststrafe wegen Beleidigung einer Amtsperson antreten. Auch fürchtet sie für ihre Tugend, seit sie Alfred in der Nähe weiß. Da erscheint dieser schon selbst und nötigt ihr das Versprechen ab, ihn zu empfangen, sobald ihr Mann "brummt". Wenige Minuten später kommt Eisenstein nach Hause, in zornigem Gespräch mit seinem Advokaten Blind, durch dessen Ungeschick die Strafe noch erhöht worden ist. Besser als Rosalinde gelingt es jetzt Eisensteins Freund Dr. Falke, den Verärgerten wieder aufzuheitern: er schlägt ihm heimlich vor, sich heute Nacht noch mit ihm bei Orlowsky zu amüsieren und seine Strafe erst morgen früh anzutreten. Vergnügt erinnert sich Eisenstein eines anderen Ballfestes, bei dem er dem als Fledermaus maskierten Falke einen Streich gespielt hat, den dieser freilich nicht vergessen hat… Mit Verwunderung sieht Rosalinde, wie sich ihr plötzlich heiter gestimmter Mann nun in Frack und Zylinder zu seinem Gang ins Gefängnis aufmacht. Mit heuchlerischer Rührung nehmen die Gatten voneinander Abschied. Adele hat inzwischen aus begreiflichen Gründen doch frei bekommen. Rosalinde empfängt nun den verliebten Alfred, der er sich sogleich in Eisensteins Schlafrock gemütlich macht und ihre Bedenken mit Wein und Gesang zerstreut. Mit der frohen Laune aber ist es vorbei, als plötzlich Gefängnisdirektor Frank erscheint, um Eisenstein persönlich abzuholen. Um Rosalindes Ehre zu retten, muss Alfred nun, ganz anders als er sich es gedacht hat, die Rolle ihres Gatten übernehmen und mit Frank ins Gefängnis abziehen.
ZWEITER AKT
Gartensalon beim Prinzen Orlowsky. Dr. Falke verspricht dem blutjungen, aber schon recht blasierten Prinzen, dass er ihm heute noch viel Gelegenheit zum Lachen geben werde: "Rache einer Fledermaus" heiße das lustige Spiel, das er vorbereitet habe. Der "Held" dieses Scherzes ist Eisenstein, der hier als Marquis Renard auftritt. Die zweite Hauptfigur ist Adele, die in einer Robe ihrer Gnädigen erscheint; sie ahnt nicht, dass sie Dr. Falke, nicht ihre Schwester Ida, herbestellt hat. Nun wird sie dem Prinzen als junge Künstlerin vorgestellt, und mit kecker Überlegenheit weist sie Eisensteins begründete Vermutung, sie sei ein Stubenmädchen, zurück. Als dritte Person in Falkes Rachespiel tritt Frank unter dem Namen Chevalier Chargrin in die Gesellschaft ein und freundet sich rasch mit dem vermeintlichen Marquis Renard an. Dr. Falke hat inzwischen Rosalinde wissen lassen, wo sich ihr angeblich im Gefängnis schmachtender Gatte in Wirklichkeit aufhält; daraufhin kommt sie ebenfalls zum Ball mit einer Maske vor den Augen und erregt bald die Aufmerksamkeit des abenteuerlustigen Eisenstein. In schlauer Weise versteht sie es, seine Taschenuhr, deren hübsches Läutwerk ihr Interesse zu wecken scheint, als Corpus Delicti an sich zu bringen. Vor der Gesellschaft, die ungern ihre Maske respektiert, weist sie sich durch den Vortrag eines Csárdás als "ungarische Gräfin" aus. Als das allgemeine Gespräch auf das Thema Fledermaus kommt, erzählt Eisenstein, wie er damals den betrunkenen Dr. Falke in seinem Fledermauskostüm am Aschermittwochmorgen in einem Gehölz abgesetzt habe, so dass er unterm Gespött der Gassenjungen maskiert den Heimweg habe antreten müssen und seitdem überall als Dr. Fledermaus gehänselt worden sei. Über die Rache, die ihm Falke dafür androht, lacht er nur, nicht ahnend, dass er schon ihr Opfer ist. In seliger Champagnerstimmung verfliegen die Stunden des Festes, bis der Glockenschlag um 6 Uhr Frank und Eisenstein zu eiligem Aufbruch mahnt.
DRITTER AKT
Kanzlei des Gefängnisdirektors. Schwer bezecht landet Frank in seinem Amt, wo ihn der slibowitzfrohe Gerichtsdiener Frosch empfängt. Er möchte gerne ein wenig ausruhen, aber schon melden sich Besuche: zuerst Adele, die ihm gesteht, wer sie wirklich ist, ihn bittet, sie für die Bühne ausbilden zu lasen, und sogleich Proben ihres Talents ablegt; dann Eisenstein, der zu seinem Staunen erfahren muss, dass der vermeintliche Chevalier Chagrin hier Gefängnisdirektor ist. Er möchte nun seinerseits beweisen, dass er nicht Marquis Renard, sondern Eisenstein sei, muss aber erfahren, dass Frank selbst Herrn von Eisenstein gestern hierhergebracht hat. Ein furchtbarer Verdacht regt sich in ihm. Um sich Gewissheit zu verschaffen, hüllt er sich in die Robe des inzwischen von Alfred herbestellten Advokaten Blind und beginnt seine gleichfalls hier eingetroffene Frau und Alfred zu verhören. In seiner Wut verrät er sich freilich bald, wird jedoch rasch kleinlaut, als ihm Rosalinde die Uhr vorweist, die sie ihm bei Orlowsky weggenommen hat. Er hat ihr also nichts vorzuwerfen. Immerhin möchte er gern, dass Alfred weiterhin an seiner Stelle die Arreststrafe absitzen soll, doch das geht natürlich nicht. Als sich schließlich die ganze Abendgesellschaft mit Orlowsky und Dr. Falke einfindet, lernt er endlich begreifen, dass er der "Rache der Fledermaus" zum Opfer fiel. Der Prinz, der sich köstlich amüsiert hat, verspricht Adele, sich als Kunstmäzen ihrer anzunehmen.